引用本文： 胡立影, 李志清, 张琰, 邵先锋, 郭小雪, 于大为, 李筱荣. 非动脉炎性前部缺血性视神经病变模型大鼠视网膜蛋白质组学定量分析. 中华眼底病杂志, 2021, 37(3): 206-213. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201124-00522 复制
非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）早期表现为视盘充血水肿，随病程进展出现视网膜神经节细胞及其轴突丢失，最终导致视神经萎缩[1-2]。目前NAION发病机制尚不清楚，炎性反应、氧化应激、谷氨酸诱导的兴奋性毒性以及某些药物的副作用可能在NAION的发病中起到重要作用[3-5]。蛋白质组学是获取生物体内蛋白质信息的最新研究技术，可用于研究疾病的发病机制及发展过程，从而寻找新的治疗靶点。近年来已应用到多种眼部疾病的研究中，如糖尿病视网膜病变、青光眼和角膜病变等[6-8]，但有关NAION的蛋白质组学相关研究鲜见报道。SWATH（sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra）是近年出现的新型蛋白质组质谱定量技术[9]，与传统蛋白质组定量方法比较，其定量准确性、灵敏度及蛋白鉴定覆盖率更高，重复性更好，对样品需求量及样本处理技术要求更低[10-11]。本研究应用SWATH定量质谱技术对NAION模型大鼠视网膜蛋白表达谱进行分析，筛选差异表达蛋白，并初步分析差异表达蛋白在NAION发生发展中的作用，为进一步研究NAION的发病机制、寻找治疗靶点奠定实验基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及实验动物
Spargue-Dawley大鼠20只，鼠龄8周，体重220～250 g，无特定病原体级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供［动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006］。大鼠饲养于天津医科大学眼科医院研究所，均置于同一间动物房，温度控制在20～22 ℃，12 h循环光照，自由饮食。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定，并获得天津医科大学眼科医院动物伦理委员会许可（伦理编号TJYY2021041029）。所有大鼠实验前经散瞳检查排除眼部疾病。
1.2 分组、建模
根据随机数字表法将大鼠分为正常对照组、NAION动物（rNAION）模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂孟加拉玫瑰红（RB）注射组（单纯光敏剂RB组），每组各为5只，均以右眼为实验眼。
rNAION模型组大鼠采用光动力疗法建立rNAION模型[12-13]。按体重0.35 ml/100 g剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，丙美卡因点眼表面麻醉。采用美国Lumenis公司532眼底激光机（Novus Spectra），激光波长532 nm，能量50 mW，光斑直径500 μm。按体重1 ml/kg的剂量经鼠尾静脉注入2.5 mmol/L光敏剂RB（美国Sigma公司）并对准视盘上2/3区域照射12 s。注射RB溶液至激光照射结束时间控制在1 min以内。建模后3 d，行裂隙灯显微镜联合前置镜、荧光素眼底血管造影（FFA）检查，以大鼠出现视神经水肿为建模成功；排除眼底出血、视网膜脱离等其他眼底病变。单纯激光照射组，仅对视盘进行激光照射，参数设置同rNAION模型组；单纯光敏剂RB组，仅注射RB溶液，注射剂量同rNAION模型组；正常对照组不给予任何处理。
建模后3 d，大鼠深度麻醉后摘除眼球，置于冰上，摘除其眼前节，取出晶状体和玻璃体，钝性分离视网膜，置于液氮中，−80 ℃冰箱冻存。
1.3 样本制备及蛋白质谱分析
提取大鼠视网膜组织蛋白，裂解后冰上超声破碎、离心、二喹啉甲酸法测浓度，经还原、烷基化后加入胰酶，终止酶切后制成肽段，取2 μg进行质谱定量检测。高效液相分离后行一级质谱和二级质谱分析，使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1程序计算每个可变窗口的质量范围。应用ProteinPilot软件（版本5.0.1）对原始数据进行检索，将其结果导入Peakview软件内置的SWATH（版本2.0）插件中，选择对应的SWATH原始数据。每个蛋白选取6个肽段，每个肽段选取6个翻译数肽段，可信度设置为99%，假阳性率设置为1%，排除修饰肽段，峰提取窗口10 min，质量偏差＜50 ppm。使用Bioconducter软件包pheatmap绘制差异表达蛋白的基因热图。
1.4 差异表达蛋白筛选
使用R语言stats包筛选rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组差异表达蛋白，筛选标准为差异表达倍数＞1.5且P＜0.05。与正常对照组比较，鉴定rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组差异表达蛋白；rNAION模型组与正常对照组比较的差异表达蛋白中，去除单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组与正常对照组比较的差异表达蛋白。绘制韦恩图和火山图。
1.5 统计学分析
对蛋白质原始定量值进行log2转换，使其满足正态分布。所有蛋白质组学数据的生物信息学统计分析使用R软件（版本3.5.3）preprocess Core包进行。采用SPSS 22.0软件的单因素方差分析对各组间蛋白表达进行差异分析，筛选差异表达倍数＞1.5且P＜0.05的蛋白作为差异蛋白，使用corrplot包进行Pearson相关性分析，并进行基因注释（GO）分析以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）。所有统计检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
FFA检查结果显示，rNAION模型组大鼠可见视盘荧光素渗漏（图1A），建模成功；单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组大鼠均未见视盘荧光素渗漏（图1B～1D）。
图1
建模后3 d不同组别大鼠视神经荧光素眼底血管造影像。1A示非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物模型组，大鼠视盘可见荧光素渗漏；1B~1D分别示单纯激光照射组、单纯光敏剂孟加拉玫瑰红组、正常对照组，大鼠视盘未见荧光素渗漏
Pearson相关性分析结果显示，rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组分别与正常对照组比较，样本相关性系数均≥0.9（图2A）。这提示蛋白质组学分析样本间的一致性良好。与正常对照组比较，rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组同时表达的差异蛋白为25个，仅在3个组表达的差异蛋白分别为184、96、101个（图2B）。
图2
定量蛋白质组学分析结果。2A示rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组Pearson相关分析组内相关系数；2B示韦恩图；2C示聚类热图，下方为差异表达蛋白基因，红色表示上调蛋白，蓝色表示下调蛋白，颜色深浅代表变化幅度大小；2D示火山图，rNAION模型组与单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组比较差异变化倍数较高的多种蛋白；红点表示上调蛋白，绿点表示下调蛋白。rNAION：非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物；AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物
rNAION模型组共筛选出差异表达倍数＞1.5且P＜0.05的蛋白184个（图2C）。其中，上调蛋白99个，包括染色质可及性复合体1、鸟嘌呤核苷酸交换因子亚基RIC1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4（GNG4）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、层粘连蛋白（LAMC）1、14-3-3γ蛋白YWHAG、锌指蛋白744、前梯度蛋白2、簇集蛋白、Ⅳ型胶原蛋白基因α1、胞质羧肽酶1（AGTPBP1）等；下调蛋白85个，包括Rho相关三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白RHOC、富含亮氨酸胶质瘤失活蛋白1（LGI1）、神经视网膜特定亮氨酸拉链蛋白、组蛋白脱乙酰基酶2（HDAC2）、分泌载体膜蛋白（SCAMP）5、网格蛋白外套蛋白AP180（SNAP91）、RNA聚合酶Ⅱ转录介体亚基21（MED21）、1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶D1、F-box蛋白家族30等（图2D）。
GO功能富集分析结果显示，细胞成分方面，细胞外外泌体、光感受器外节、囊泡、中间丝、神经丝、突触、细胞膜、细胞质及线粒体等被显著富集（P＜0.05）；细胞功能方面，Rab-GTP家族蛋白结合、蛋白结合、丝氨酸蛋白酶抑制剂活性、多聚RNA结合、泛素蛋白连接酶活性、GTP激酶激活活性、结构分子活性、金属离子结合等被显著富集（P＜0.05）；生物学过程方面，急性反应、金属离子反应、突触可塑性调节、生长发育、凋亡及炎症反应等被显著富集（P＜0.05）（图3）。
图3
差异表达蛋白参与的生物学进程、细胞成分、分子功能的基因注释富集分析结果
KEGG信号通路富集分析结果显示，NAION主要参与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、补体和凝血酶联反应、免疫反应、信号转导等通路（图4）。
图4
京都基因与基因组百科全书的信号通路富集分析结果。差异蛋白参与的信号通路。ECM：细胞外基质；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B
WGCNA结果显示，与NAION相关性最高的上调蛋白为AGTPBP1、Ral GTPase激活蛋白亚基β、转移相关蛋白MTA2、E3泛素蛋白连接酶LRSAM1、三结构域蛋白67，下调蛋白为SNAP91、SCAMP5、HDAC2、线粒体解偶联蛋白4、MED21等。上调蛋白参与的分子功能包括神经传导、生长发育、细胞代谢、蛋白质合成与分解、信号转导等；下调蛋白参与的分子功能包括囊泡介导的转运、能量代谢、神经发育、细胞代谢、离子通道运输等（图5）。
图5
WGCNA结果。5A示非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）动物模型组差异表达蛋白分布于20个颜色模块中，其中红色、绿色模块中的蛋白与NAION相关性最高，绿色表示富集的上调蛋白，红色表示富集的下调蛋白。AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物；RB：孟加拉玫瑰红。5B示上调蛋白参与的生物学功能。1. 轴突转运；2. 有机磷酸酯生物合成过程；3. 黄体酮受体信号通路；4. 细胞器官组织的正调控；5. 树突运输；6. 细胞生长发育；7. 磷脂代谢过程的调节；8. 调节细胞成分的大小；9. 酰基辅酶A代谢过程；10. 染色体组织调节；11. 蛋白质稳定性调节；12. 脱磷酸化作用；13. 参与细胞蛋白分解代谢过程的蛋白质水解的调节；14. 染色质的组装或拆卸；15. mRNA加工；16. 蛋白质脱乙酰作用；17. 磷脂代谢过程；18. 蛋白质位置的维持；19. 受体簇；20. 生理性肌肉肥大。 5C示下调蛋白参与的生物学功能。1. 突触中囊泡介导的转运；2. 囊泡介导转运的调节；3. 线粒体跨膜转运；4. 高尔基体的囊泡转运；5. 对甲状腺球蛋白三碘甲状腺原氨酸的反应；6. 二价金属离子的转运；7. 溶酶体组织；8. 神经发生的正调节；9. 突触后特殊结构的维持；10. 视觉感知；11. 细胞对葡萄糖饥饿的反应；12. 蛋白酶体蛋白分解代谢过程；13. 基于肌动蛋白的过程；14. 碳水化合物的转运；15. 蛋白质酰化；16. 细胞分解代谢过程的调节；17. 细胞对碳水化合物刺激的反应；18. 胰岛素受体信号通路；19. 铁离子传输；20. 药物运输金属离子的转运；7. 溶酶体组织；8. 神经发生的正调节；9. 突触后特殊结构的维持；10. 视觉感知；11. 细胞对葡萄糖饥饿的反应；12. 蛋白酶体蛋白分解代谢过程；13. 基于肌动蛋白的过程；14. 碳水化合物的转运；15. 蛋白质酰化；16. 细胞分解代谢过程的调节；17. 细胞对碳水化合物刺激的反应；18. 胰岛素受体信号通路；19. 铁离子传输；20. 药物运输。rNAION：非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物；AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物；RB：孟加拉玫瑰红。
3 讨论
NAION是临床常见视神经病变，蛋白质组学技术是探究生物体内与疾病相关致病蛋白及寻找治疗靶点的一种重要技术手段，然而目前NAION蛋白质组学的相关研究鲜见报道。许多研究均已证实该模型可模拟NAION的病理过程，为NAION的相关基础研究提供帮助[3, 12, 14-15]。本研究采用SWATH技术对NAION急性期大鼠模型的视网膜进行蛋白质组学分析，从而寻找NAION相关的生物学标记物。Fard等[16]发现，在啮齿动物缺血性视神经病变发生后8 d时有43%的神经节细胞丢失，而临床中绝大多数患者为急性期就诊患者，因此我们选择的取材时间点定于造模后第3天来模拟急性期NAION的病理过程。
本研究结果显示，rNAION模型组上调蛋白、下调蛋白变化明显的分别为GFAP、GNG4、LAMC1、YWHAG等和LGI1、SNAP91、SCAMP5等。其中，GFAP在哺乳动物中被用作视网膜和视神经星形胶质细胞的标志物，在缺血再灌注、外伤性视神经病变及青光眼的视神经中，GFAP阳性细胞的密度显著增加[17-19]。这说明胶质细胞激活。本研究中GFAP蛋白表达上调，这提示胶质细胞激活参与了NAION的发病过程。
PI3K/AKT信号通路在高眼压、视神经炎、缺血缺氧性脑损伤及神经退行性病变造成的神经损害方面发挥着重要作用[20-22]。本研究富集分析结果显示，PI3K/AKT信号通路在NAION疾病中发挥重要作用，涉及的候选蛋白有GNG4、LAMC1及YWHAG。LAMC是一种细胞外基质蛋白，通过在施旺细胞表面组装基底膜以促进周围神经髓鞘形成[23]，LAMC1参与神经元的发育。既往研究表明，LAMC1在斑马鱼视杯形态发生过程起重要作用，干扰LAMC1蛋白功能损害基底收缩力和视杯折叠[24]。囊胚的神经发育受复杂转录程序的严格调控，LAMC1蛋白表达失调与转录因子Rest表型异常密切相关，从而影响胚胎干细胞神经发育过程中多能基因的表达[25]。此外，LAMC1蛋白还可通过PI3K/AKT通路参与肿瘤细胞增生和代谢等多种过程[26]。GNG4是几种跨膜信号系统的调制器和换能器[27]，在止血和胰高血糖素反应中发挥重要作用[28]，目前尚无其在眼部功能的研究报道。GNG4在神经发育过程中具有重要意义，是衰老过程中认知功能下降的神经递质途径基因, 与阿尔茨海默病密切相关，并且在胶质母细胞瘤发生发展中具有抑制肿瘤细胞生长的作用[29-30]。YWHAG蛋白属于蛋白质14-3-3家族，通过与丝氨酸蛋白磷酸化的相互作用参与信号转导[31]。其在中枢神经系统中高度表达，通过影响皮质发育和神经元迁移来参与神经系统发育[32-33]。YWHAG蛋白表达异常可引起智力障碍、癫痫、自闭症及阿尔茨海默病等[34-36]。此外，YWHAG蛋白上调可抑制胶质母细胞瘤细胞活力、增生、迁移、侵袭和有丝分裂[37]。目前未见YWHAG蛋白在人类眼部的研究报道，但在小鼠视网膜中可检测到其表达[38]。我们推测，GNG4、LAMC1、YWHAG蛋白等可能与NAION发病后神经细胞再生与修复过程密切相关。
rNAION模型组表达下降的蛋白有LGI1、SNAP91、SCAMP5。LGI1蛋白是一种分泌蛋白，定位于谷氨酸能突触，可影响轴突的再生和树突修剪，在神经系统发育中起着至关重要的作用[39-40]，在NAION中可能与视神经损伤后轴突再生功能相关。此外，NAION发生时患眼出现视盘水肿，轴浆流运输障碍[15]。因此，与突触囊泡运输功能相关的蛋白表达往往出现异常，如SNAP91、SCAMP5。SNAP91可编码一种突触相关蛋白，人体不同部位均有表达，其在大脑中表达最高[41]。既往研究结果表明，SNAP91与帕金森及精神分裂症的发病具有一定相关性[39, 42]；表达水平降低与胶质瘤发病亦密切相关，且与病变等级呈负相关[43]。SCAMP是一类完整的膜蛋白家族，在动物体内普遍表达，并且在分泌膜中含量很高[44]。SCAMP5在神经元中高表达, 高浓度汇聚于突触小泡中[45]。SCAMP5的降低可表现出明显的突触抑制，其功能障碍可改变大脑神经元网络的兴奋和（或）抑制平衡，从而可导致自闭症、癫痫发作[46-47]。目前虽缺乏SCAMP5在眼部的研究报道，但其未来有可能成为新的研究靶点。
本研究存在的不足：（1）rNAION模型尚不能完全模拟NAION患者疾病发病过程。（2）蛋白质组学技术本身存在局限性，如不能全部检出生物体内的蛋白，并且检出的蛋白存在假阳性的可能等，本研究未能进行个体蛋白的功能验证，我们后续将根据差异蛋白表达倍数及其生物学功能选择靶蛋白进一步进行验证。（3）本研究仅进行了急性期蛋白质组学分析，未进行慢性期蛋白质组学分析，尚不能观察差异蛋白的动态发展变化，并会遗漏部分仅表达于慢性期的差异蛋白。
非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）早期表现为视盘充血水肿，随病程进展出现视网膜神经节细胞及其轴突丢失，最终导致视神经萎缩[1-2]。目前NAION发病机制尚不清楚，炎性反应、氧化应激、谷氨酸诱导的兴奋性毒性以及某些药物的副作用可能在NAION的发病中起到重要作用[3-5]。蛋白质组学是获取生物体内蛋白质信息的最新研究技术，可用于研究疾病的发病机制及发展过程，从而寻找新的治疗靶点。近年来已应用到多种眼部疾病的研究中，如糖尿病视网膜病变、青光眼和角膜病变等[6-8]，但有关NAION的蛋白质组学相关研究鲜见报道。SWATH（sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra）是近年出现的新型蛋白质组质谱定量技术[9]，与传统蛋白质组定量方法比较，其定量准确性、灵敏度及蛋白鉴定覆盖率更高，重复性更好，对样品需求量及样本处理技术要求更低[10-11]。本研究应用SWATH定量质谱技术对NAION模型大鼠视网膜蛋白表达谱进行分析，筛选差异表达蛋白，并初步分析差异表达蛋白在NAION发生发展中的作用，为进一步研究NAION的发病机制、寻找治疗靶点奠定实验基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及实验动物
Spargue-Dawley大鼠20只，鼠龄8周，体重220～250 g，无特定病原体级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供［动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006］。大鼠饲养于天津医科大学眼科医院研究所，均置于同一间动物房，温度控制在20～22 ℃，12 h循环光照，自由饮食。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定，并获得天津医科大学眼科医院动物伦理委员会许可（伦理编号TJYY2021041029）。所有大鼠实验前经散瞳检查排除眼部疾病。
1.2 分组、建模
根据随机数字表法将大鼠分为正常对照组、NAION动物（rNAION）模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂孟加拉玫瑰红（RB）注射组（单纯光敏剂RB组），每组各为5只，均以右眼为实验眼。
rNAION模型组大鼠采用光动力疗法建立rNAION模型[12-13]。按体重0.35 ml/100 g剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，丙美卡因点眼表面麻醉。采用美国Lumenis公司532眼底激光机（Novus Spectra），激光波长532 nm，能量50 mW，光斑直径500 μm。按体重1 ml/kg的剂量经鼠尾静脉注入2.5 mmol/L光敏剂RB（美国Sigma公司）并对准视盘上2/3区域照射12 s。注射RB溶液至激光照射结束时间控制在1 min以内。建模后3 d，行裂隙灯显微镜联合前置镜、荧光素眼底血管造影（FFA）检查，以大鼠出现视神经水肿为建模成功；排除眼底出血、视网膜脱离等其他眼底病变。单纯激光照射组，仅对视盘进行激光照射，参数设置同rNAION模型组；单纯光敏剂RB组，仅注射RB溶液，注射剂量同rNAION模型组；正常对照组不给予任何处理。
建模后3 d，大鼠深度麻醉后摘除眼球，置于冰上，摘除其眼前节，取出晶状体和玻璃体，钝性分离视网膜，置于液氮中，−80 ℃冰箱冻存。
1.3 样本制备及蛋白质谱分析
提取大鼠视网膜组织蛋白，裂解后冰上超声破碎、离心、二喹啉甲酸法测浓度，经还原、烷基化后加入胰酶，终止酶切后制成肽段，取2 μg进行质谱定量检测。高效液相分离后行一级质谱和二级质谱分析，使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1程序计算每个可变窗口的质量范围。应用ProteinPilot软件（版本5.0.1）对原始数据进行检索，将其结果导入Peakview软件内置的SWATH（版本2.0）插件中，选择对应的SWATH原始数据。每个蛋白选取6个肽段，每个肽段选取6个翻译数肽段，可信度设置为99%，假阳性率设置为1%，排除修饰肽段，峰提取窗口10 min，质量偏差＜50 ppm。使用Bioconducter软件包pheatmap绘制差异表达蛋白的基因热图。
1.4 差异表达蛋白筛选
使用R语言stats包筛选rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组差异表达蛋白，筛选标准为差异表达倍数＞1.5且P＜0.05。与正常对照组比较，鉴定rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组差异表达蛋白；rNAION模型组与正常对照组比较的差异表达蛋白中，去除单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组与正常对照组比较的差异表达蛋白。绘制韦恩图和火山图。
1.5 统计学分析
对蛋白质原始定量值进行log2转换，使其满足正态分布。所有蛋白质组学数据的生物信息学统计分析使用R软件（版本3.5.3）preprocess Core包进行。采用SPSS 22.0软件的单因素方差分析对各组间蛋白表达进行差异分析，筛选差异表达倍数＞1.5且P＜0.05的蛋白作为差异蛋白，使用corrplot包进行Pearson相关性分析，并进行基因注释（GO）分析以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）。所有统计检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
FFA检查结果显示，rNAION模型组大鼠可见视盘荧光素渗漏（图1A），建模成功；单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组大鼠均未见视盘荧光素渗漏（图1B～1D）。
图1
建模后3 d不同组别大鼠视神经荧光素眼底血管造影像。1A示非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物模型组，大鼠视盘可见荧光素渗漏；1B~1D分别示单纯激光照射组、单纯光敏剂孟加拉玫瑰红组、正常对照组，大鼠视盘未见荧光素渗漏
Pearson相关性分析结果显示，rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组分别与正常对照组比较，样本相关性系数均≥0.9（图2A）。这提示蛋白质组学分析样本间的一致性良好。与正常对照组比较，rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组同时表达的差异蛋白为25个，仅在3个组表达的差异蛋白分别为184、96、101个（图2B）。
图2
定量蛋白质组学分析结果。2A示rNAION模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组Pearson相关分析组内相关系数；2B示韦恩图；2C示聚类热图，下方为差异表达蛋白基因，红色表示上调蛋白，蓝色表示下调蛋白，颜色深浅代表变化幅度大小；2D示火山图，rNAION模型组与单纯激光照射组、单纯光敏剂RB组、正常对照组比较差异变化倍数较高的多种蛋白；红点表示上调蛋白，绿点表示下调蛋白。rNAION：非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物；AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物
rNAION模型组共筛选出差异表达倍数＞1.5且P＜0.05的蛋白184个（图2C）。其中，上调蛋白99个，包括染色质可及性复合体1、鸟嘌呤核苷酸交换因子亚基RIC1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4（GNG4）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、层粘连蛋白（LAMC）1、14-3-3γ蛋白YWHAG、锌指蛋白744、前梯度蛋白2、簇集蛋白、Ⅳ型胶原蛋白基因α1、胞质羧肽酶1（AGTPBP1）等；下调蛋白85个，包括Rho相关三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白RHOC、富含亮氨酸胶质瘤失活蛋白1（LGI1）、神经视网膜特定亮氨酸拉链蛋白、组蛋白脱乙酰基酶2（HDAC2）、分泌载体膜蛋白（SCAMP）5、网格蛋白外套蛋白AP180（SNAP91）、RNA聚合酶Ⅱ转录介体亚基21（MED21）、1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶D1、F-box蛋白家族30等（图2D）。
GO功能富集分析结果显示，细胞成分方面，细胞外外泌体、光感受器外节、囊泡、中间丝、神经丝、突触、细胞膜、细胞质及线粒体等被显著富集（P＜0.05）；细胞功能方面，Rab-GTP家族蛋白结合、蛋白结合、丝氨酸蛋白酶抑制剂活性、多聚RNA结合、泛素蛋白连接酶活性、GTP激酶激活活性、结构分子活性、金属离子结合等被显著富集（P＜0.05）；生物学过程方面，急性反应、金属离子反应、突触可塑性调节、生长发育、凋亡及炎症反应等被显著富集（P＜0.05）（图3）。
图3
差异表达蛋白参与的生物学进程、细胞成分、分子功能的基因注释富集分析结果
KEGG信号通路富集分析结果显示，NAION主要参与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、补体和凝血酶联反应、免疫反应、信号转导等通路（图4）。
图4
京都基因与基因组百科全书的信号通路富集分析结果。差异蛋白参与的信号通路。ECM：细胞外基质；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B
WGCNA结果显示，与NAION相关性最高的上调蛋白为AGTPBP1、Ral GTPase激活蛋白亚基β、转移相关蛋白MTA2、E3泛素蛋白连接酶LRSAM1、三结构域蛋白67，下调蛋白为SNAP91、SCAMP5、HDAC2、线粒体解偶联蛋白4、MED21等。上调蛋白参与的分子功能包括神经传导、生长发育、细胞代谢、蛋白质合成与分解、信号转导等；下调蛋白参与的分子功能包括囊泡介导的转运、能量代谢、神经发育、细胞代谢、离子通道运输等（图5）。
图5
WGCNA结果。5A示非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）动物模型组差异表达蛋白分布于20个颜色模块中，其中红色、绿色模块中的蛋白与NAION相关性最高，绿色表示富集的上调蛋白，红色表示富集的下调蛋白。AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物；RB：孟加拉玫瑰红。5B示上调蛋白参与的生物学功能。1. 轴突转运；2. 有机磷酸酯生物合成过程；3. 黄体酮受体信号通路；4. 细胞器官组织的正调控；5. 树突运输；6. 细胞生长发育；7. 磷脂代谢过程的调节；8. 调节细胞成分的大小；9. 酰基辅酶A代谢过程；10. 染色体组织调节；11. 蛋白质稳定性调节；12. 脱磷酸化作用；13. 参与细胞蛋白分解代谢过程的蛋白质水解的调节；14. 染色质的组装或拆卸；15. mRNA加工；16. 蛋白质脱乙酰作用；17. 磷脂代谢过程；18. 蛋白质位置的维持；19. 受体簇；20. 生理性肌肉肥大。 5C示下调蛋白参与的生物学功能。1. 突触中囊泡介导的转运；2. 囊泡介导转运的调节；3. 线粒体跨膜转运；4. 高尔基体的囊泡转运；5. 对甲状腺球蛋白三碘甲状腺原氨酸的反应；6. 二价金属离子的转运；7. 溶酶体组织；8. 神经发生的正调节；9. 突触后特殊结构的维持；10. 视觉感知；11. 细胞对葡萄糖饥饿的反应；12. 蛋白酶体蛋白分解代谢过程；13. 基于肌动蛋白的过程；14. 碳水化合物的转运；15. 蛋白质酰化；16. 细胞分解代谢过程的调节；17. 细胞对碳水化合物刺激的反应；18. 胰岛素受体信号通路；19. 铁离子传输；20. 药物运输金属离子的转运；7. 溶酶体组织；8. 神经发生的正调节；9. 突触后特殊结构的维持；10. 视觉感知；11. 细胞对葡萄糖饥饿的反应；12. 蛋白酶体蛋白分解代谢过程；13. 基于肌动蛋白的过程；14. 碳水化合物的转运；15. 蛋白质酰化；16. 细胞分解代谢过程的调节；17. 细胞对碳水化合物刺激的反应；18. 胰岛素受体信号通路；19. 铁离子传输；20. 药物运输。rNAION：非动脉炎性前部缺血性视神经病变动物；AION：前部缺血性视神经病；RB：孟加拉玫瑰红；LC：单纯激光照射；N：正常组动物；RB：孟加拉玫瑰红。
3 讨论
NAION是临床常见视神经病变，蛋白质组学技术是探究生物体内与疾病相关致病蛋白及寻找治疗靶点的一种重要技术手段，然而目前NAION蛋白质组学的相关研究鲜见报道。许多研究均已证实该模型可模拟NAION的病理过程，为NAION的相关基础研究提供帮助[3, 12, 14-15]。本研究采用SWATH技术对NAION急性期大鼠模型的视网膜进行蛋白质组学分析，从而寻找NAION相关的生物学标记物。Fard等[16]发现，在啮齿动物缺血性视神经病变发生后8 d时有43%的神经节细胞丢失，而临床中绝大多数患者为急性期就诊患者，因此我们选择的取材时间点定于造模后第3天来模拟急性期NAION的病理过程。
本研究结果显示，rNAION模型组上调蛋白、下调蛋白变化明显的分别为GFAP、GNG4、LAMC1、YWHAG等和LGI1、SNAP91、SCAMP5等。其中，GFAP在哺乳动物中被用作视网膜和视神经星形胶质细胞的标志物，在缺血再灌注、外伤性视神经病变及青光眼的视神经中，GFAP阳性细胞的密度显著增加[17-19]。这说明胶质细胞激活。本研究中GFAP蛋白表达上调，这提示胶质细胞激活参与了NAION的发病过程。
PI3K/AKT信号通路在高眼压、视神经炎、缺血缺氧性脑损伤及神经退行性病变造成的神经损害方面发挥着重要作用[20-22]。本研究富集分析结果显示，PI3K/AKT信号通路在NAION疾病中发挥重要作用，涉及的候选蛋白有GNG4、LAMC1及YWHAG。LAMC是一种细胞外基质蛋白，通过在施旺细胞表面组装基底膜以促进周围神经髓鞘形成[23]，LAMC1参与神经元的发育。既往研究表明，LAMC1在斑马鱼视杯形态发生过程起重要作用，干扰LAMC1蛋白功能损害基底收缩力和视杯折叠[24]。囊胚的神经发育受复杂转录程序的严格调控，LAMC1蛋白表达失调与转录因子Rest表型异常密切相关，从而影响胚胎干细胞神经发育过程中多能基因的表达[25]。此外，LAMC1蛋白还可通过PI3K/AKT通路参与肿瘤细胞增生和代谢等多种过程[26]。GNG4是几种跨膜信号系统的调制器和换能器[27]，在止血和胰高血糖素反应中发挥重要作用[28]，目前尚无其在眼部功能的研究报道。GNG4在神经发育过程中具有重要意义，是衰老过程中认知功能下降的神经递质途径基因, 与阿尔茨海默病密切相关，并且在胶质母细胞瘤发生发展中具有抑制肿瘤细胞生长的作用[29-30]。YWHAG蛋白属于蛋白质14-3-3家族，通过与丝氨酸蛋白磷酸化的相互作用参与信号转导[31]。其在中枢神经系统中高度表达，通过影响皮质发育和神经元迁移来参与神经系统发育[32-33]。YWHAG蛋白表达异常可引起智力障碍、癫痫、自闭症及阿尔茨海默病等[34-36]。此外，YWHAG蛋白上调可抑制胶质母细胞瘤细胞活力、增生、迁移、侵袭和有丝分裂[37]。目前未见YWHAG蛋白在人类眼部的研究报道，但在小鼠视网膜中可检测到其表达[38]。我们推测，GNG4、LAMC1、YWHAG蛋白等可能与NAION发病后神经细胞再生与修复过程密切相关。
rNAION模型组表达下降的蛋白有LGI1、SNAP91、SCAMP5。LGI1蛋白是一种分泌蛋白，定位于谷氨酸能突触，可影响轴突的再生和树突修剪，在神经系统发育中起着至关重要的作用[39-40]，在NAION中可能与视神经损伤后轴突再生功能相关。此外，NAION发生时患眼出现视盘水肿，轴浆流运输障碍[15]。因此，与突触囊泡运输功能相关的蛋白表达往往出现异常，如SNAP91、SCAMP5。SNAP91可编码一种突触相关蛋白，人体不同部位均有表达，其在大脑中表达最高[41]。既往研究结果表明，SNAP91与帕金森及精神分裂症的发病具有一定相关性[39, 42]；表达水平降低与胶质瘤发病亦密切相关，且与病变等级呈负相关[43]。SCAMP是一类完整的膜蛋白家族，在动物体内普遍表达，并且在分泌膜中含量很高[44]。SCAMP5在神经元中高表达, 高浓度汇聚于突触小泡中[45]。SCAMP5的降低可表现出明显的突触抑制，其功能障碍可改变大脑神经元网络的兴奋和（或）抑制平衡，从而可导致自闭症、癫痫发作[46-47]。目前虽缺乏SCAMP5在眼部的研究报道，但其未来有可能成为新的研究靶点。
本研究存在的不足：（1）rNAION模型尚不能完全模拟NAION患者疾病发病过程。（2）蛋白质组学技术本身存在局限性，如不能全部检出生物体内的蛋白，并且检出的蛋白存在假阳性的可能等，本研究未能进行个体蛋白的功能验证，我们后续将根据差异蛋白表达倍数及其生物学功能选择靶蛋白进一步进行验证。（3）本研究仅进行了急性期蛋白质组学分析，未进行慢性期蛋白质组学分析，尚不能观察差异蛋白的动态发展变化，并会遗漏部分仅表达于慢性期的差异蛋白。
