引用本文： 朱青, 李亚, 游雅, 施晓萌, 雷博. PCDH15基因复合杂合新突变致无色素性视网膜色素变性表型的1F型Usher综合征一家系. 中华眼底病杂志, 2021, 37(6): 444-448. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200928-00473 复制
无色素性视网膜色素变性（RPSP）是一种非典型性原发性视网膜色素变性（RP），约占非综合征型RP患者的10%[1]。RPSP患者眼底无或仅有极少色素沉着，临床仅凭眼底检查极易造成漏诊。Usher综合征（USH）是一种以耳聋和RP为特征的常染色体隐性遗传性疾病[2-3]。临床根据听力和前庭功能受累情况将其分为3种临床亚型，其中1型最为严重，表现为先天性重度听力下降、前庭功能障碍和青春期前发病的RP。USH具有遗传异质性，迄今已鉴定出包括PCDH15在内的7种1型USH致病基因（RETNET，https://sph.uth.edu/RetNet/）。PCDH15基因定位于10号染色体长臂，主要在耳蜗毛细胞及视网膜光感受器细胞中表达[4]。一项人群PCDH15变异频谱研究发现，PCDH15基因胞内结构域中的截短变异发生率较高，且导致1F型USH的可能性极低[5]。基因型表型相关性研究表明，PCDH15基因错义突变与非综合征型耳聋发生有关，而无功能变异则与1型USH相关[6]。目前国内以RPSP为临床表型的USH研究鲜见报道。我们在临床中发现具有RPSP表型的USH一家系，采用基于靶向捕获的二代测序技术对其家系进行了基因突变检测，借助共分离验证及生物信息学分析，明确了其致病突变位点PCDH15基因c.4109dupA（p.K1370fs）（M1）、c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）（M2）。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审批[批文号：HNEECKY-2019（15号）]，遵循《赫尔辛基宣言》原则，患儿监护人及受检者均获知情并签署书面知情同意书。
2019年11月于河南省立眼科医院检查确诊的具有RPSP表型的1F型USH患者1例和其父母纳入研究。1F型USH诊断标准：致病基因为PCDH15，表现为先天性重度听力下降，前庭功能障碍，青春期前发病的RP。详细询问患儿病史和家族史。受检者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）、光相干断层扫描（OCT）、视野检查。家族史和临床检查结果符合RPSP诊断标准[7]。
先证者女，9岁。主诉双眼夜盲4年余，听觉下降7年。纯音测听检查示患儿双耳听力重度下降。BCVA：右眼0.5+（+1.25DS/−2.00DC×160），左眼0.5+（+1.75DS/−1.00DC×20）。眼底视盘边界清楚、颜色淡红，黄斑中心凹反光可见，未见明显色素沉着（图1A，1B）。OCT检查示周边视网膜外层变薄，椭圆体带消失（图1C，1D）。双眼中周边视野的视敏度普遍性下降（图1E，1F）。ERG检查示双眼视杆系统反应重度下降，呈熄灭型；闪光VEP检查，双眼P2波潜伏期正常，波幅正常（图1G～1J）。患儿父母表型正常。
图1
无色素性视网膜色素变性伴1F型Usher综合征患儿彩色眼底、光相干断层扫描（OCT）、视野及视网膜电图检查像。1A、1B分别示右眼、左眼彩色眼底像。双眼周边视网膜色灰暗，色素上皮萎缩，未见明显色素沉着。1C、1D分别示右眼、左眼OCT像。双眼黄斑中心凹结构存在，周边视网膜外层变薄且椭圆体带消失。1E、1F分别示右眼、左眼视野检查灰度图。双眼中周边视野的光敏感度下降。1G、1H和1I、1J分别示右眼、左眼的明适应和暗适应视网膜电图检查像。双眼暗适应和明适应波幅重度下降
采集受检者外周静脉血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因组DNA提取试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA，紫外分光光度计定量。经片段化、连接接头、扩增纯化后，利用液相杂交法将自主研发设计的探针（PS400）与目标区域结合，杂交捕获376个与视网膜遗传病相关基因的外显子区域和相邻内含子区域（50碱基对）及已知内含子突变。捕获到的DNA经洗脱和扩增纯化后，使用高通量测序仪（Illumina）进行测序。测序数据采用XYGeneRanger2.0软件与UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对和鉴别遗传变异，并收集目标区域的覆盖度和平均测序深度等质量参数。视网膜遗传病相关基因检测测序目标区域平均测序深度为300×，其中99%的目标序列测序深度达＞30×[8]。采用MutationTaster蛋白预测软件，并依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）于2015年发布的《序列变异解读标准和指南》[9]评估其遗传变异的致病性。
对检测出的可疑致病突变扩展至家系成员进行Sanger测序验证。使用生物信息学技术预测变异对编码蛋白的影响，应用SWISS-MODEL和PSIPRED预测野生型与M1突变型蛋白结构模型。
2 结果
基因检测结果显示，先证者PCDH15基因有2个可疑杂合突变，即M1：c.4109dupA（p.K1370fs），M2：c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）。2个杂合变异均未在正常人群数据库中检出，且人类基因突变数据库（HGMD）、ClinVar数据库未报道。Mutation Taster预测为致病性变异。经Sanger测序验证，患儿母亲携带杂合变异M1，父亲携带杂合变异M2，变异在该家系中呈共分离状态。经ACMG指南评估M1和M2均为PCDH15基因新发现致病性变异（PVS1、PM2、PP1、PP3、PP4）。
比对uniprot数据库PCDH15蛋白（A2A3D8_HUMAN）结构域信息，结合TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测，PCDH15蛋白第1380～1402位氨基酸构成蛋白的跨膜结构域。M1突变型蛋白的跨膜结构域消失。与正常的同源序列比较，变异M1改变了PCDH15蛋白序列第1371～1407位37个氨基酸并出现终止，使编码蛋白跨膜区的疏水性与α螺旋结构均发生显著变化（图2～4）。PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）预测M1突变改变了编码蛋白质膜的亚细胞定位，突变型多数分布于线粒体及细胞质中而非质膜。变异M2发生于基因起始端的信号肽结构域，使蛋白翻译提前终止于第7个密码子，预测无法合成蛋白产物。
图2
PCDH15蛋白序列在多个物种中的保守性分析图。PCDH15 c.4109dupA（p.K1370fs）所对应的氨基酸位点在人（Homo sapiens）、斑马鱼（Danio rerio）、家鸡（Gallus gallus）、小家鼠（Mus musculus）、猫头鹰猴（Aotus nancymaae）、猕猴（Macaca mulatta）、家兔（Oryctolagus cuniculus）中均高度保守（红色线框内为跨膜区氨基酸序列）
图3
PCDH15蛋白氨基酸序列跨膜区预测及亲疏水性分析。3A、3B分别示野生型、M1突变型TMHMM跨膜预测结果。可见M1突变型蛋白序列跨膜结构域消失。3C、3D分别示野生型、M1突变型Kyte和Doolittle亲疏水性分析。峰值越高，疏水性越强。M1突变型蛋白序列原跨膜区疏水性发生显著改变（红色线框内为跨膜区）
图4
PCDH15蛋白拓扑结构分析图。4A示野生型，蛋白第1371～1407位氨基酸使用灰色标出，具有正常的α跨膜螺旋结构；4B示M1突变型，突变位点导致正常的跨膜结构发生改变
根据临床表型、基因变异致病性以及蛋白结构预测，最终临床诊断PCDH15相关1F型USH。
3 讨论
原发性RP早期症状为夜盲、视野向心性缩小，ERG表现为视杆-视锥型细胞变性[10]，其中ERG是确诊RPSP重要的一项客观检查[11-12]。本例患儿临床表现、眼底彩色照相、ERG和视野检查结果均符合RPSP典型表现，结合患儿有先天性耳聋表现，临床初步诊断为USH。
通过靶向捕获高通量测序技术对此患儿家系进行致病基因分析，发现PCDH15基因可疑致病复合杂合突变。一个为遗传自母亲的移码突变，另一个为遗传自父亲的无义突变。PCDH15基因编码介导细胞间黏附的钙依赖性内在膜蛋白，由1个胞外信号肽、11个胞外钙结合结构域、1个跨膜结构域和1个独特的胞内结构域组成，对维持正常的视网膜和耳蜗功能具有重要作用[6]。与在耳蜗静纤毛中作用方式相似，USH1蛋白在人类、灵长类和两栖类动物光感受器细胞中被认为是一种膜耦合蛋白，介导光感受器细胞外节和环绕其外的萼状突起之间的黏附[13]。PCDH15基因敲减的热带爪蟾，其光感受器细胞的萼状突起被破坏，光感受器细胞外节出现异常的形态且功能下降[14]。本研究发现的移码突变c.4109dupA（p.K1370fs），其插入位点位于PCDH15基因编码蛋白的胞外侧，移码导致整个编码蛋白跨膜区氨基酸序列发生变化，蛋白编码提前终止于临近跨膜区的胞内侧。PCDH15蛋白（UniProtKB-A2A3D8）第1380～1402位氨基酸形成α跨膜螺旋结构，其跨膜性质的决定因素包括氨基酸序列的长度和疏水性，疏水性错配和界面锚固，极性残基和脯氨酸等[15]。α螺旋跨膜蛋白的跨膜与否取决于整个跨膜序列的疏水性强弱[16]。使用Kyte和Doolittle疏水分析法预测出M1突变型产物相比野生型1380～1402位氨基酸序列疏水性发生显著改变[17]，因此预测该肽段没有足够的疏水性成为跨膜区。无义突变c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）插入的碱基产生终止密码子，使蛋白质合成提前终止于胞外信号肽结构域处，导致编码蛋白无法合成。该两种变异预测会产生截短的转录本，通过无义介导的mRNA衰变的细胞保护性机制而降解[18]，或产生截短的蛋白产物。对移码突变c.4109dupA（p.K1370fs）产生的突变型蛋白结构进行预测，发现其改变了编码蛋白的α螺旋跨膜结构，影响了蛋白的正常跨膜与定位，使编码蛋白无法发挥其正常膜耦合功能，进而破坏光感受器细胞与静纤毛正常形态和功能，引起眼与耳部的异常表现。
根据患者临床表型、基因变异致病性以及蛋白结构与功能预测，本例患儿最终诊断为与PCDH15基因相关的1F型USH。患儿眼底未发现明显的骨细胞样色素沉着，临床诊断中可能会漏诊。因此，对此类患者应进行常规ERG检查和基因检测。
目前对于USH尚无有效的治疗办法。对听力障碍者可建议其佩戴助听器，早期植入人工耳蜗有助于重度听力受损患儿语言能力的提高[19]。腺相关病毒介导的基因替代治疗在部分早期RP患者中取得良好效果，但这种方法不适用于大基因（＞4.5 kb），如PCDH15。因此在治疗尚未取得突破性进展的情况下，基因筛查产前诊断和遗传咨询显得尤为重要。
PCDH15基因新的复合杂合突变导致本例患儿出现非典型性RP和听力下降。2个新发现变异c.4109dupA、c.17dupA，导致PCDH15蛋白无法正常合成，继而引起眼部及耳部异常表现。本研究拓展了PCDH15基因导致USH的基因突变谱和临床表型谱。
无色素性视网膜色素变性（RPSP）是一种非典型性原发性视网膜色素变性（RP），约占非综合征型RP患者的10%[1]。RPSP患者眼底无或仅有极少色素沉着，临床仅凭眼底检查极易造成漏诊。Usher综合征（USH）是一种以耳聋和RP为特征的常染色体隐性遗传性疾病[2-3]。临床根据听力和前庭功能受累情况将其分为3种临床亚型，其中1型最为严重，表现为先天性重度听力下降、前庭功能障碍和青春期前发病的RP。USH具有遗传异质性，迄今已鉴定出包括PCDH15在内的7种1型USH致病基因（RETNET，https://sph.uth.edu/RetNet/）。PCDH15基因定位于10号染色体长臂，主要在耳蜗毛细胞及视网膜光感受器细胞中表达[4]。一项人群PCDH15变异频谱研究发现，PCDH15基因胞内结构域中的截短变异发生率较高，且导致1F型USH的可能性极低[5]。基因型表型相关性研究表明，PCDH15基因错义突变与非综合征型耳聋发生有关，而无功能变异则与1型USH相关[6]。目前国内以RPSP为临床表型的USH研究鲜见报道。我们在临床中发现具有RPSP表型的USH一家系，采用基于靶向捕获的二代测序技术对其家系进行了基因突变检测，借助共分离验证及生物信息学分析，明确了其致病突变位点PCDH15基因c.4109dupA（p.K1370fs）（M1）、c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）（M2）。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审批[批文号：HNEECKY-2019（15号）]，遵循《赫尔辛基宣言》原则，患儿监护人及受检者均获知情并签署书面知情同意书。
2019年11月于河南省立眼科医院检查确诊的具有RPSP表型的1F型USH患者1例和其父母纳入研究。1F型USH诊断标准：致病基因为PCDH15，表现为先天性重度听力下降，前庭功能障碍，青春期前发病的RP。详细询问患儿病史和家族史。受检者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）、光相干断层扫描（OCT）、视野检查。家族史和临床检查结果符合RPSP诊断标准[7]。
先证者女，9岁。主诉双眼夜盲4年余，听觉下降7年。纯音测听检查示患儿双耳听力重度下降。BCVA：右眼0.5+（+1.25DS/−2.00DC×160），左眼0.5+（+1.75DS/−1.00DC×20）。眼底视盘边界清楚、颜色淡红，黄斑中心凹反光可见，未见明显色素沉着（图1A，1B）。OCT检查示周边视网膜外层变薄，椭圆体带消失（图1C，1D）。双眼中周边视野的视敏度普遍性下降（图1E，1F）。ERG检查示双眼视杆系统反应重度下降，呈熄灭型；闪光VEP检查，双眼P2波潜伏期正常，波幅正常（图1G～1J）。患儿父母表型正常。
图1
无色素性视网膜色素变性伴1F型Usher综合征患儿彩色眼底、光相干断层扫描（OCT）、视野及视网膜电图检查像。1A、1B分别示右眼、左眼彩色眼底像。双眼周边视网膜色灰暗，色素上皮萎缩，未见明显色素沉着。1C、1D分别示右眼、左眼OCT像。双眼黄斑中心凹结构存在，周边视网膜外层变薄且椭圆体带消失。1E、1F分别示右眼、左眼视野检查灰度图。双眼中周边视野的光敏感度下降。1G、1H和1I、1J分别示右眼、左眼的明适应和暗适应视网膜电图检查像。双眼暗适应和明适应波幅重度下降
采集受检者外周静脉血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因组DNA提取试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA，紫外分光光度计定量。经片段化、连接接头、扩增纯化后，利用液相杂交法将自主研发设计的探针（PS400）与目标区域结合，杂交捕获376个与视网膜遗传病相关基因的外显子区域和相邻内含子区域（50碱基对）及已知内含子突变。捕获到的DNA经洗脱和扩增纯化后，使用高通量测序仪（Illumina）进行测序。测序数据采用XYGeneRanger2.0软件与UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对和鉴别遗传变异，并收集目标区域的覆盖度和平均测序深度等质量参数。视网膜遗传病相关基因检测测序目标区域平均测序深度为300×，其中99%的目标序列测序深度达＞30×[8]。采用MutationTaster蛋白预测软件，并依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）于2015年发布的《序列变异解读标准和指南》[9]评估其遗传变异的致病性。
对检测出的可疑致病突变扩展至家系成员进行Sanger测序验证。使用生物信息学技术预测变异对编码蛋白的影响，应用SWISS-MODEL和PSIPRED预测野生型与M1突变型蛋白结构模型。
2 结果
基因检测结果显示，先证者PCDH15基因有2个可疑杂合突变，即M1：c.4109dupA（p.K1370fs），M2：c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）。2个杂合变异均未在正常人群数据库中检出，且人类基因突变数据库（HGMD）、ClinVar数据库未报道。Mutation Taster预测为致病性变异。经Sanger测序验证，患儿母亲携带杂合变异M1，父亲携带杂合变异M2，变异在该家系中呈共分离状态。经ACMG指南评估M1和M2均为PCDH15基因新发现致病性变异（PVS1、PM2、PP1、PP3、PP4）。
比对uniprot数据库PCDH15蛋白（A2A3D8_HUMAN）结构域信息，结合TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测，PCDH15蛋白第1380～1402位氨基酸构成蛋白的跨膜结构域。M1突变型蛋白的跨膜结构域消失。与正常的同源序列比较，变异M1改变了PCDH15蛋白序列第1371～1407位37个氨基酸并出现终止，使编码蛋白跨膜区的疏水性与α螺旋结构均发生显著变化（图2～4）。PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）预测M1突变改变了编码蛋白质膜的亚细胞定位，突变型多数分布于线粒体及细胞质中而非质膜。变异M2发生于基因起始端的信号肽结构域，使蛋白翻译提前终止于第7个密码子，预测无法合成蛋白产物。
图2
PCDH15蛋白序列在多个物种中的保守性分析图。PCDH15 c.4109dupA（p.K1370fs）所对应的氨基酸位点在人（Homo sapiens）、斑马鱼（Danio rerio）、家鸡（Gallus gallus）、小家鼠（Mus musculus）、猫头鹰猴（Aotus nancymaae）、猕猴（Macaca mulatta）、家兔（Oryctolagus cuniculus）中均高度保守（红色线框内为跨膜区氨基酸序列）
图3
PCDH15蛋白氨基酸序列跨膜区预测及亲疏水性分析。3A、3B分别示野生型、M1突变型TMHMM跨膜预测结果。可见M1突变型蛋白序列跨膜结构域消失。3C、3D分别示野生型、M1突变型Kyte和Doolittle亲疏水性分析。峰值越高，疏水性越强。M1突变型蛋白序列原跨膜区疏水性发生显著改变（红色线框内为跨膜区）
图4
PCDH15蛋白拓扑结构分析图。4A示野生型，蛋白第1371～1407位氨基酸使用灰色标出，具有正常的α跨膜螺旋结构；4B示M1突变型，突变位点导致正常的跨膜结构发生改变
根据临床表型、基因变异致病性以及蛋白结构预测，最终临床诊断PCDH15相关1F型USH。
3 讨论
原发性RP早期症状为夜盲、视野向心性缩小，ERG表现为视杆-视锥型细胞变性[10]，其中ERG是确诊RPSP重要的一项客观检查[11-12]。本例患儿临床表现、眼底彩色照相、ERG和视野检查结果均符合RPSP典型表现，结合患儿有先天性耳聋表现，临床初步诊断为USH。
通过靶向捕获高通量测序技术对此患儿家系进行致病基因分析，发现PCDH15基因可疑致病复合杂合突变。一个为遗传自母亲的移码突变，另一个为遗传自父亲的无义突变。PCDH15基因编码介导细胞间黏附的钙依赖性内在膜蛋白，由1个胞外信号肽、11个胞外钙结合结构域、1个跨膜结构域和1个独特的胞内结构域组成，对维持正常的视网膜和耳蜗功能具有重要作用[6]。与在耳蜗静纤毛中作用方式相似，USH1蛋白在人类、灵长类和两栖类动物光感受器细胞中被认为是一种膜耦合蛋白，介导光感受器细胞外节和环绕其外的萼状突起之间的黏附[13]。PCDH15基因敲减的热带爪蟾，其光感受器细胞的萼状突起被破坏，光感受器细胞外节出现异常的形态且功能下降[14]。本研究发现的移码突变c.4109dupA（p.K1370fs），其插入位点位于PCDH15基因编码蛋白的胞外侧，移码导致整个编码蛋白跨膜区氨基酸序列发生变化，蛋白编码提前终止于临近跨膜区的胞内侧。PCDH15蛋白（UniProtKB-A2A3D8）第1380～1402位氨基酸形成α跨膜螺旋结构，其跨膜性质的决定因素包括氨基酸序列的长度和疏水性，疏水性错配和界面锚固，极性残基和脯氨酸等[15]。α螺旋跨膜蛋白的跨膜与否取决于整个跨膜序列的疏水性强弱[16]。使用Kyte和Doolittle疏水分析法预测出M1突变型产物相比野生型1380～1402位氨基酸序列疏水性发生显著改变[17]，因此预测该肽段没有足够的疏水性成为跨膜区。无义突变c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）插入的碱基产生终止密码子，使蛋白质合成提前终止于胞外信号肽结构域处，导致编码蛋白无法合成。该两种变异预测会产生截短的转录本，通过无义介导的mRNA衰变的细胞保护性机制而降解[18]，或产生截短的蛋白产物。对移码突变c.4109dupA（p.K1370fs）产生的突变型蛋白结构进行预测，发现其改变了编码蛋白的α螺旋跨膜结构，影响了蛋白的正常跨膜与定位，使编码蛋白无法发挥其正常膜耦合功能，进而破坏光感受器细胞与静纤毛正常形态和功能，引起眼与耳部的异常表现。
根据患者临床表型、基因变异致病性以及蛋白结构与功能预测，本例患儿最终诊断为与PCDH15基因相关的1F型USH。患儿眼底未发现明显的骨细胞样色素沉着，临床诊断中可能会漏诊。因此，对此类患者应进行常规ERG检查和基因检测。
目前对于USH尚无有效的治疗办法。对听力障碍者可建议其佩戴助听器，早期植入人工耳蜗有助于重度听力受损患儿语言能力的提高[19]。腺相关病毒介导的基因替代治疗在部分早期RP患者中取得良好效果，但这种方法不适用于大基因（＞4.5 kb），如PCDH15。因此在治疗尚未取得突破性进展的情况下，基因筛查产前诊断和遗传咨询显得尤为重要。
PCDH15基因新的复合杂合突变导致本例患儿出现非典型性RP和听力下降。2个新发现变异c.4109dupA、c.17dupA，导致PCDH15蛋白无法正常合成，继而引起眼部及耳部异常表现。本研究拓展了PCDH15基因导致USH的基因突变谱和临床表型谱。
